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手掌離心機(jī)在蜂蜜樣本中氯霉素殘留量分析中的

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-07-29 14:36【

氯霉素是一種對革蘭氏陰性菌以及陽性菌都 有很好抑制作用的抗生素,曾經(jīng)對畜禽疾病的控 制和治療起到了特別重要的作用。由于氯霉素藥 性比較穩(wěn)定而且價格比較便宜,在養(yǎng)蜂業(yè)中經(jīng)常 會使用氯霉素,用于防止蜜蜂爬蜂病,因此蜂蜜 中可能含有氯霉素殘留。如果大量食用含有氯霉 素殘留的食物會使人產(chǎn)生耐藥菌株,而且會破壞 人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)。氯霉素存在嚴(yán)重的 副作用,能引起人的再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺 乏癥等疾病。因此,美國規(guī)定在動物性食品中不 得檢出氯霉素,歐共體不允許氯霉素用于產(chǎn)奶母 牛和產(chǎn)蛋雞。歐盟已明文規(guī)定了氯霉素等多種抗 生素藥物不再作為獸藥使用。國外對進(jìn)口蜂蜜中 氯霉素的殘留限量定在0.1 µg/kg。


抗生素殘留檢測方法目前主要有微生物法、 理化檢測法、免疫分析法。微生物法存在 操作時間長、結(jié)果偏差大等缺點,很難定量檢 測。理化檢測法需要昂貴的檢測儀器及專業(yè)的操 作技能,結(jié)果準(zhǔn)確,常作為最終確證的方法。色 譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前比較成熟而且可以 投入到實際操作的抗生素檢測技術(shù),優(yōu)點是靈敏 度較高、分辨率高,可進(jìn)行定性和定量分析,同 時可檢測多個抗生素種類,但是由于前處理步驟 較多,費(fèi)時,而且需要大型儀器設(shè)備,所以很難 在一些小型的食品檢測企業(yè)或農(nóng)場進(jìn)行推廣,僅 僅適用于檢驗檢疫部門用來作為終判的方法。因 此,更加簡單快速、低成本的分析檢測方法需要 被開發(fā)出來以滿足實際生產(chǎn)的需要。免疫分析法 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、通量性高 等優(yōu)點,已逐漸成為初篩的首選方法。免疫分析 法的基本原理是抗原或半抗原和抗體發(fā)生特異性 的免疫反應(yīng),常用的方法包括試紙條法和酶聯(lián)免 疫吸附法。試紙條法簡單快速,酶聯(lián)免疫吸附法 可以定量,但一次只能檢測一個指標(biāo)。


蛋白質(zhì)芯片方法又稱蛋白質(zhì)微陣列,是在基 因芯片之后發(fā)展起來的一種分析方法。其原理是 對固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理,再將已知的大 量蛋白(如酶、抗體、抗原、細(xì)胞因子等)有規(guī)律 地固定在上面,根據(jù)這些大分子蛋白的特點,捕 獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白(存在于血清、血 漿、淋巴、組織液等),然后用芯片分析儀進(jìn)行掃 描,對結(jié)果進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)芯片方法在動物源 性食品抗生素殘留的檢測方面應(yīng)用很廣泛。 蛋白芯片方法是一種高通量的檢測方法,能在一 次實驗中提供大量的信息。靈敏度高,可以準(zhǔn)確 檢測出蛋白樣品中微量蛋白的含量,檢測水平已 達(dá)納克級,而且所需的樣品量少??梢源蟠蠼档?檢測的成本,同時也提高了檢測的效率。目前, 蛋白芯片方法逐漸成為免疫分析方法的發(fā)展方向 之一,受到越來越廣泛地重視。


1 實驗部分

1.1 試劑與儀器


NaCl、KCl、NA2HPO4 .12H2O、KH2PO4、吐 溫20、乙二胺四乙酸(EDTA):分析純,南京化學(xué) 試劑有限公司;牛血清白蛋白(BSA):99%,w/w 美國默克公司;氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司;氯霉 素抗體、納米材料標(biāo)記的二抗、銀增強(qiáng)顯色溶液 (A液、B液):南京祥中生物科技有限公司。 實驗所用水均為18.25 MΩ/cm純凈水(Milli-Q 水凈化系統(tǒng))。10 mmol/L PBS(磷酸鹽緩沖液) pH7.2作為分析緩沖液。洗滌緩沖液PBS含0.05% 吐溫20(PBST)。封閉劑為1% BSA。所有緩沖液在使用前通過0.22 µm孔徑過濾器過濾。生物芯片點樣儀:清華大學(xué);ELx50自動洗板 機(jī):美國biotech儀器有限公司;MD-200恒溫振蕩 儀Thermo-shaker、Qarray 2000芯片分析儀、96孔 板芯片載體:南京祥中生物科技有限公司;渦旋 混合器、Lx-100手掌型離心機(jī):江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;單道可調(diào)移液器:百得 實驗室儀器蘇州有限公司。


1.2 方法與步驟

1.2.1 氯霉素抗原的制備


稱取10 mg氯霉素和丁 二酸酐溶于1 mL丙酮,振蕩反應(yīng)1.5 h。于40 ℃ 氮吹后,加入200 µL DMSO溶解殘留物,再分別 加入200 µL 5 mg/mL EDC和NHS溶液,振蕩反應(yīng) 2 h。再加入2 mL 5 mg/mL BSA溶液,振蕩反應(yīng)4 h,4 ℃下用1xPBS透析3 d,然后分裝,—20 ℃冷 凍保存?zhèn)溆谩?/span>



1.2.2 生物芯片的制備

陽性對照和制備得到的氯 霉素抗原溶液(CAP-BSA)用生物芯片點樣儀在96 孔板芯片底部制備陣列。共6個陣列點(2×3陣 列),每個陣列點約40 nL,陣列間距約500 µm的 微陣列生物芯片,每個溶液重復(fù)3個陣列點。點樣 后,在37 ℃下孵育2 h。為了減少非特異性吸附, 固定后每孔加入200 µL 10 mg/mL BSA,在37 ℃ 封閉1 h。封閉后,生物芯片孔板用1×PBST緩沖 液洗板,拍干,然后用鋁箔袋密封存儲在2~8 ℃ 備用。



1.2.3 間接競爭微陣列免疫分析法

本論文采用的 是間接競爭微陣列免疫分析原理,見圖1。在微 陣列免疫分析中,進(jìn)行了以下實驗過程。每孔中 加入25 µL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品,再加入已知量的25 µL 混合抗體,25 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/ min)。清洗后再加入50 µL AgNPS標(biāo)記的羊抗鼠 IgG,37 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/min)。 洗滌后再加入50 µL銀增強(qiáng)顯色溶液(包括溶液A和 溶液B),在37 ℃中避光反應(yīng)12 min。顯色反應(yīng)結(jié)束后,再清洗3次。




2 結(jié)果與討論

2.1 氯霉素抗原的紫外表征


氯霉素、BSA都有紫外吸收,但偶聯(lián)后的抗 原,由于共軛體系等的變化,使得其紫外吸收光 譜曲線和λmax都會發(fā)生相應(yīng)的改變。因此可以用來鑒定抗原是否偶聯(lián)成功。氯霉素的濃度為0.01 mol/L,BSA的濃度為1 mg/mL,紫外吸收光譜見 圖2。由圖2可知,氯霉素的最大吸收波長為270 nm,BSA的最大吸收波長為280 nm,偶聯(lián)后氯霉 素抗原的最大吸收波長為276 nm,與氯霉素相比 最大吸收波長發(fā)生了紅移,說明氯霉素抗原偶聯(lián) 成功。2.2 抗原、抗體和二抗?jié)舛葍?yōu)化 氯霉素抗原、抗體、二抗?jié)舛仁怯绊懜偁幮?免疫檢測靈敏度的主要因素,因此檢測前要對其 濃度進(jìn)行優(yōu)化。在本文中,氯霉素抗原濃度分 別為1:4,1:8,1:16稀釋;抗體分別為1:80000、 1:160000、1:240000、1:320000稀釋,二抗1:50、 1:100、1:200稀釋。 抗原抗體的濃度低,靈敏度高,但相對灰度 信號值(RLUs)也會降低。綜合兩者,選擇相對灰 度信號值在40000左右,確定最佳測定條件為: 氯霉素抗原最佳濃度為1:8,抗體最佳質(zhì)濃度均為 1:160000,二抗最佳濃度為1:100。



3 結(jié)論

本論文開發(fā)的蛋白芯片快速檢測方法具有操 作簡單、高通量、快速低成本等特點。氯霉素的 檢出限是0.02 ng/mL,定量限為0.03 ng/mL。本方 法靈敏度高,同時也不需要復(fù)雜的樣品前處理。 因此,新開發(fā)的蛋白芯片方法,具有良好的靈敏 度和簡單的儀器設(shè)備,同時具有較低的檢出限和 較好的回收率。利用蛋白芯片法可以快速準(zhǔn)確測 定蜂蜜中的氯霉素殘留量,具有快速、并行性、 高通量的特點,適用于現(xiàn)場大規(guī)模樣品的初篩。 在動物源性食品殘留抗生素的含量檢測方面有廣 闊的發(fā)展前景。



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