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調(diào)節(jié)膽囊癌細胞活力和遷移-其林貝爾搖床的使用

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-10-11 09:40【

膽囊癌是消化道常見惡性腫瘤,分為原發(fā)性和 繼發(fā)性。原發(fā)性膽囊癌可發(fā)生于膽囊任何部位,以 膽囊底及膽囊頸多見。原發(fā)性膽囊癌的發(fā)病率 在消化道腫瘤居第 5 位。繼發(fā)性膽囊癌所占極少一 部分,主要來自消化系腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。近年 來,很多文獻報道,黏液蛋白在炎癥向腫瘤的進展過 程中起到了很重要的作用。黏蛋白 16( mucin16, MUC16) 基因是編碼 CA125 的基因,是一種由各類 上皮細胞表達的高分子量糖蛋白,其在上皮細胞表 面發(fā)揮保護和修復上皮的作用。

1. 材料

人膽囊癌細胞系( GBC-SD) 細胞購自深圳市豪 地華拓生物科技有限公司( HTX1663) 。人 MUC16 質(zhì)粒 購 自 上 海 泰 冷 生 物 科 技 有 限 公 司 ( TV094025001) 。PI3K 抑制劑 BKM120 購自上海 邁瑞爾化學技術(shù)有限公司( M29995) 。Lipo2000 購 自 Thermo Fisher Scientific 公司( 11668027) 。RPMI1640 培養(yǎng)基購自 GE Health 公司( SH30091) ,F(xiàn)BS 購自 Thermo Fisher Scientific 公 司 ( 10099-133 ) 。 MUC16、MMP-9、p-Akt、Akt,抗微管蛋白( tubulin) 抗 體購自 abcam 公司( ab1107,ab73734,EP2109Y, ab85683,ab7291) ???PI3K 抗 體 購 自 CST 公 司 ( 4249) 。蛋白酶抑制劑 Cocktail ( 不含 EDTA,小片 劑) 購自 Bimake 公司( B14011) 。PBS 購自上海生 工生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 ( E607008) 。TRIzolTM Reagent 購自成都東勝科創(chuàng)科 技有限公司 ( 15596026) 。青鏈霉素混合液( ×100) 購自北京索萊寶科技有限公司( P1400) 。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上 海海方生物技術(shù)有限公司( A0005) 。Real-time PCR 試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司( 600828) 。 2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生 物技術(shù)有限責任公司( WB-0081) 。蛋白裂解液購自 上海碧云天生物技術(shù)有限公司( P0013) 。MMP-9 和 MUC16 的 siRNA 序列由上海生工生物工程股份有 限公司合成,序列見表 1。GAPDH、MMP-1、MMP-2、 MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Real-time PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。 Western blotting 裝 置 ( Bio-rad ) ; 酶 標 儀 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 細胞培養(yǎng)箱( Thermo Fisher Scientific 公 司 ) ; 生 物 安 全 柜 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 微量加樣器( Gilson 公司) ; 冷凍離 心機( Eppendorf 公司) ; 旋轉(zhuǎn)搖床( 海門其林貝爾儀器制造有限公司) ; 脫色搖床( 北京大龍興創(chuàng)實驗儀 器有限公司) 。

2. 方法

維 持在補充有 2 mmol /L L-谷氨酰胺、0. 1IU /L 青霉素、100 mg /L 鏈霉素和 10%熱滅活 FBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中,并在潮濕氣氛( 37 ℃,5%CO2 ) 中培 養(yǎng)。BKM120 以終濃度 5 μmol /L 處理人膽囊癌細 胞 GBC-SD,8 h 后 收 獲 細 胞。通 過 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染人膽囊癌細胞 GBC-SD。將含目的基因的 質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合,靜止大約 20 min 后,緩緩滴入 GBC-SD 細胞。每 106 個細胞轉(zhuǎn)染 4 μg MUC16 質(zhì)粒。 siMUC16 和 siMMP-9 的轉(zhuǎn)染濃度為 100 nmol /L。 2. 2 RNA 抽取和 Real-time PCR: 將 GBC-SD 細胞 用細胞刮刮下,裝入 1. 5 ml 的 EP 管中,用 PBS 洗 3 次。使用 Trizol 抽取 GBC-SD 的總 RNA。使用反轉(zhuǎn) 錄試劑盒將純化好的總 RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。再使用 GAPDH、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Real-time PCR 引物和熒光定量 PCR 試劑 盒在 ABI7500 儀器上進行 Real-time PCR 反應(yīng),實驗 重復 3 次。進行 8%或 10% SDS-PAGE 的凝 膠 電 泳,然 后 轉(zhuǎn) 移 到 Immobilon-P PVDF 膜 ( 0. 45 μm 孔 徑) 。將 PVDF 膜在室溫下用含有 0. 01% Tween-20 和 5%脫脂奶粉的 Tris 緩沖液( 10 mmol Tris-HCl,pH 7. 5,150 mmol /L NaCl) 封閉 1 h, 然后在 4 ℃ 下與 MUC16( 鼠,1 ∶1000) ,MMP-9( 兔, 1 ∶3000) ,p-Akt ( 兔,1 ∶ 1000) ,AKT ( 兔,1 ∶ 2000) , PI3K( 兔,1 ∶3000) ,微管蛋白( 鼠,1 ∶10 000) 抗體溫 育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有 HRP 的相應(yīng) 二抗( 鼠抗兔: 1 ∶ 4000,兔抗兔: 1 ∶ 4000) 孵育 1 h。 觀察特定蛋白質(zhì)使用 ECL Plus Western blotting 跡檢 測系統(tǒng)。96 孔板中分配 100 μl EC109 細胞懸浮 液( 5000 個細胞/孔) 。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵 育 24 h( 37 ℃,5%CO2 條件下) 。將 10 μl 不同濃度 的待測物質(zhì)加入板中。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適 當?shù)臅r間( 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d) 。向板的每個孔中 加入 10μl CCK-8 溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育 4 h。使用酶標儀測量 450 nm 處的吸光度。

3 結(jié)果

用 MUC16 質(zhì) 粒 過 表 達 MUC16 蛋 白 后,通 過 Real-time PCR 實 驗,發(fā) 現(xiàn) MMPs 家 族 中 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 與對照組差異無顯 著性( P>0. 05) ,而 MMP-9 的 mRNA 水平明顯升高, 此差異具有統(tǒng)計學意義( P<0. 05) 。 2. MUC16 通過激活 PI3K /Akt 通路促進 MMP-9 的表達過表達 MUC16 后,通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn), MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明顯升高,而 Akt 蛋 白的總量無明顯變化。而敲低 MUC16 后,通過免疫 印跡,發(fā)現(xiàn) MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明顯降 低,而 Akt 蛋白的總量無明顯變化。在 過 表 達 MUC16 的基礎(chǔ)上再使用 PI3K /Akt 通路的抑制劑 BKM120 處理后,通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),p-Akt、 PI3K、MMP-9 和 Akt 蛋白的總量無明顯變化。

4 討論 

源于膽囊上皮的膽囊癌是膽道系統(tǒng)中最常見 的惡性腫瘤。手術(shù)切除是目前已知的唯一確 定有效的治療手段,但手術(shù)切除率低于 30%,只有 5. 2% ~ 22%的患者有條件施行治愈性手術(shù)。一 旦患者出現(xiàn)嚴重腹疼、黃疽、體重減輕和膽囊包塊等 膽囊癌的典型癥狀和體征,疾病即已進入進展期,幾 乎沒有完全切除的可能。膽囊癌的預(yù)后極差,主 要原因是腫瘤發(fā)展迅速,在臨床出現(xiàn)癥狀之前較早 發(fā)生周圍組織的侵犯和肝臟及遠處轉(zhuǎn)移腫瘤的侵襲 轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的決定因素之一,對轉(zhuǎn)移的機 制和抗轉(zhuǎn)移研究是近年來腫瘤學的研究熱點和抗癌 治療的突破方向。本研究中我們發(fā)現(xiàn),MUC16 激活 PI3K /Akt 通路促進 MMP-9 的蛋白表達,進而 提升膽囊癌細胞 GBC-SD 的細胞活力和遷移能力。

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