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其林貝爾

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聚球體模型的建立(其林貝爾QL-902使用)

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-12-26 12:00【

藥物引發(fā)的肝毒性問題是終止新藥研發(fā)和導致 藥物退市最主要的因素之一,同時也是政府監(jiān)管行 為最常見的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等 均因嚴重肝毒性而被迫撤回。藥物引起肝損傷的發(fā) 病機制主要有藥物直接損害、間接損害( 包括細胞 毒性和膽汁淤積性) 、免疫介導性肝損傷、炎癥反 應、線粒體失能以及機體對藥物的特異質反應。在 相關發(fā)病機制中,我們對膽汁淤積性肝毒性知之甚 少,其臨床前預測也僅限于評估藥物抑制膽鹽輸出 泵的能力,缺乏完善的評價標準。


1 藥品與試劑 


ASP,APAP,Nef,Tol,F(xiàn)A( 美國 Cayman 公司) ; Tro( 美國 RD 公司) ; Iso( 美國 Enzo 公司) ; 青霉素、 鏈霉素、胎牛血清、Willams'Medium E 培養(yǎng)基( Gibco 公司) ; 引物合成( Invitrogen 公司) ; TRNzol 總 RNA 提取試劑、DL2,000 DNA Marker [TaKaRa( 寶生物) 公司]; 抗體( Abcam 公司) 。 


2 儀器 


RT-PCR 試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒( Qiagen 公司) ; 96 孔板( 美國 Corning 公司) ; CO2 培養(yǎng)箱 ( 美國 ThemoForma 公司) ; CCK8 試劑盒( 日本同仁 化學研究所) ; 尿素檢測試劑盒( Abcom 公司) ; QL-902 渦旋振蕩儀( 海門市其林貝爾儀器制造有限公 司) ; Centrifuge 5415D 離 心 機 ( Eppendorf 公 司) ; NANODROP 2000 分光光度計( Therno Scientific 公 司) ; Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)( 上海天能科技有限 公司) ; ABI7500 熒光定量 PCR 儀( Applied Biosystems 公 司) ; ELX 800 酶標 儀 ( 美 國 Bio-Tek 公 司) ; HR220 掌上離心機( Servicebio 公司) ; Nikon Eclipse E100 正置熒光顯微鏡( 日本尼康公司) 。 


3 細胞 


HepG2 細胞( 本實驗室凍存) ; HepaRG 細胞( 美 國 Millipore 公司) 。 4 2D 及 3D 細胞培養(yǎng) HepaRG 和 HepG2 細胞接種于含 10% 胎牛血 清,100 μmL - 1青霉素、100 μg·mL - 1鏈霉素、4 mmol· L - 1 L-谷氨酰胺的 Williams'Medium E 培養(yǎng)基中,于 5% CO2 的 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),達到 70% ~ 80% 融合時,吸棄培養(yǎng)基,PBS 清洗,加胰酶鏡下觀 察細胞回縮變圓時終止消化,加少量培養(yǎng)基輕輕吹 打制備細胞懸液,并傳代。3D 培養(yǎng)條件下,將 HepaRG 分別以每孔 100,200,400,800,1 600 個接種于 U 型底低吸附 96 孔板中,于 37 ℃,5% 的 CO2 培養(yǎng) 箱中培養(yǎng),形成3D 微球結構,可持續(xù)培養(yǎng)28 d,其間 通過鏡下觀察球體變化并記錄其直徑大小。


通過優(yōu)化實驗條件成功構建了 3D HepaRG 肝毒性評價模型,能夠從一定程度上反映出該 體外模型的優(yōu)勢,也可以為膽汁淤積性肝損傷的研 究提供一定的借鑒,但論據(jù)尚不充分,在接下來的研 究中,將利用高內涵篩選技術檢測化合物對細胞活 力、代謝凋亡及信號轉導等各個環(huán)節(jié)的影響,進一步 探明引起藥物肝損傷的毒性機制,從而為化合物的 安全性預測提供實驗依據(jù)。




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